对草地贪夜蛾高毒力的苏云金芽胞杆菌菌株筛选与杀虫活性研究

草地贪夜蛾是一种世界性重大农业害虫，给玉米等多种主要粮食和经济作物造成严重危害。为实现对草地贪夜蛾的高效、绿色、持续防控，亟需筛选高毒力苏云金芽胞杆菌菌株资源。本研究以前期实验室储备的对斜纹夜蛾、小地老虎具有杀虫活性的363株野生菌株库为候选菌株，基于菌株杀虫基因差异及进化关系，去除冗余菌株后获得172株候选菌株。通过培养获取这些菌株胞晶混合物，进行杀虫蛋白定量后，测定杀虫活性，获得27株对草地贪夜蛾初孵幼虫具有较高杀虫活性的菌株，其中菌株B14-D2的杀虫活性最高，LC₅₀为0.155 μg/g。克隆了该菌株中的cry1Ea3基因并在HD73^-无晶体突变株中表达，Cry1Ea3蛋白对草地贪夜蛾初孵幼虫LC₅₀为1.789 μg/g。本研究为新的Bt产品和杀虫基因的开发利用提供了丰富资源。     

5种生物制剂对马铃薯种薯萌芽、极端天气下植株生长和产量性状的影响

旨在满足马铃薯生产中茬口衔接、机械化生产技术应用、不利气候下稳产等对马铃薯出苗早、齐、壮的需求,以‘费乌瑞它’为供试品种,用基于有益活菌或工程菌提取物的5种生物制剂进行种薯处理,对多重性状进行了对比分析。5种生物制剂较常规化学制剂,均能够不同程度地促进种薯萌芽和芽根同生,出苗期提前2~7天,播种后49天的出苗率提高3.33%~17.78%。其中,表现最好的为酵母核苷酸衍生物和VDAL,种薯萌发和生根均显著高于对照。霜冻后,生物剂拌种处理在恢复前期促进植株生长,由此促进恢复后期的块茎发育,较常规化学处理增产8.39%~24.03%,体现了不同程度的保产效果。多马道黑、酵母核苷酸衍生物、根肽和VDAL体现出较好的保产效果,可作为种薯处理剂投入马铃薯生产。     

不同水肥条件下夏玉米/冬小麦农田生态系统碳平衡研究

农田生态系统碳平衡取决于农作物固定碳量和土壤异养呼吸排放碳量。为揭示水肥用量对农田生态系统碳平衡的综合影响，设置3个灌水水平：高水、中水和低水（W1、W0.85、W0.7夏玉米季分别为90、76.5、63mm，冬小麦季分别为140、119、98mm），4个施氮水平：高氮、中氮、低氮和不施氮（N1、N0.85、N0.7、N0夏玉米季分别为300、255、210、0kg/hm2，冬小麦季分别为210、178.5、147、0kg/hm2），4个施磷水平：高磷、中磷、低磷和不施磷（P1、P0.85、P0.7和P0夏玉米季分别为90、76.5、63、0kg/hm2，冬小麦季分别为150、127.5、105、0kg/hm2）进行了田间试验。结果表明：不同水肥处理下夏玉米/冬小麦农田生态系统表现为碳汇，夏玉米季净生态系统生产力固碳量（CNEP）为6805~7233kg/hm2，冬小麦季CNEP为5842~6434kg/hm2，夏玉米CNEP高于冬小麦。在高、中、低肥水平下，增加灌水量，夏玉米/冬小麦周年净初级生产力固碳量（CNPP）提高2.48%~5.96%，土壤微生物异养呼吸碳释放量（CRm）增加2.15%~15.20%，净生态系统生产力固碳量（CNEP）增加1.16%~6.47%。在高、中、低供水水平下，增加施肥量，夏玉米/冬小麦周年CNPP增加2.95%~3.43%，土壤CRm增加5.23%~18.67%，CNEP增加0.93%~2.79%，CNEP增加比例与供水水平呈负相关。在低水条件下，氮磷肥配施处理夏玉米/冬小麦农田周年CNEP较单施氮、磷肥分别增加4.86%、7.34%，且氮磷肥交互作用显著（P<0.05），水肥供应水平相差15%时对冬小麦农田CNEP有显著的正交互作用。氮磷肥配施、水肥协调供应均有助于促进夏玉米/冬小麦农田生态系统的净碳输入，在节水节肥原则下，夏玉米和冬小麦分别在W0.85N0.85P0.85和W0.7N0.85P0.85水肥供应条件下有利于增加农田CNEP。     

CnAβ基因对大鼠RBL-2H3细胞脱颗粒的影响

过敏是人和养殖动物常见的疾病，而且发生的频率呈现逐渐增加的趋势。为了深入了解过敏反应的机制，本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建钙调磷酸酶A beta （calcineurin A beta，CnAβ）基因敲除的大鼠RBL-2H3细胞株，并探讨CnAβ基因对RBL-2H3细胞生长及脱颗粒的影响。选取大鼠CnAβ基因第一外显子为敲除靶点，设计并合成3个单导向RNA （single guide RNA，sgRNA），构建pX459-CnAβ-sgRNA质粒，并用脂质体3000将构建好的质粒转染到RBL-2H3细胞内；利用嘌呤霉素对转染细胞进行筛选，通过DNA测序验证获得CnAβ基因敲除的RBL-2H3细胞株；并检测CnAβ基因缺失对细胞增殖和脱颗粒的影响。结果表明，成功构建了CnAβ单基因敲除的大鼠RBL-2H3细胞株；CnAβ基因缺失对RBL-2H3细胞增殖、细胞的颗粒形成以及颗粒含量无显著影响，但显著抑制由细胞表面受体介导的RBL-2H3细胞脱颗粒作用。该研究结果有助于深入了解动物过敏性疾病的发生机制，为动物过敏性疾病的预防提供了理论基础。     

极小种群植物“川柿”生物学特性及种子萌发方法研究

摘 要：【目的】为了保护和发展极小种群植物川柿，开展此研究。【方法】采用观测法，连续3年对其生物学特性研究；种子萌发方法：（1）后熟0、30、45、60天，剥离清洗播种；（2）后熟60天，以GA300、600、1000 mg/L溶液浸种1h；播种基质为河沙（保持一定湿度），放置室内，统计萌发时间和出苗率。【结果】（1）川柿花期4-5月，10月为果熟期，单果直径32.7±5.80mm，单果重23.0±5.30g；种子肾形、千粒重1070g；成年植株呈隔年开花、结果现象；（2）种子经“后熟+河沙播种”，可萌发，其中以后熟60天的出苗率较高，为65%；直接播种种子，出苗率5%；“后熟+GA溶液浸种+河沙播种”，出苗率均高于65%，其中以GA600mg/L浸泡1h处理，出苗率最高为83.3%。【结论】极小种群植物川柿为常绿叶乔木，有隔年开花、结果现象； “果后熟60天+GA600mg/L浸泡种子1h +室内河沙播种”可提高种子萌发率，为川柿种子繁殖提供参考。     

Shikonin inhibits neuronal apoptosis induced by OGD through targeting PI3K/Akt signaling pathway

AIM: To explore the effect of shikonin on rat primary cortical neurons in oxygen-glucose deprivation (OGD)-induced injury model.METHODS: The neurons were pretreated with shikonin at different concentrations (0.02, 0.2, 2 and 20 μmol/L) followed by treatment with OGD. Lactate dehydrogenase (LDH) release assay and fluorescein diacetate/propidium iodide (FDA/PI) double staining were used to detect neuronal viability and apoptosis, and then the optimal concentration of shikonin was determined. LY294002 (PI3K/Akt signaling pathway inhibitor, 1 μmol/L) was added before the addition of shikonin, and the protein level of p-Akt (Ser473) in the neurons was determined by Wes-tern blot. LDH release assay and FDA/PI double staining were also used to detect neuronal viability and apoptosis.RESULTS: A certain concentration (0.2~20 μmol/L) of shikonin increased the viability of impaired neurons (P<0.05) and the protein level of p-Akt (Ser473) in the neurons (P<0.05). The effect of shikonin on neuronal p-Akt (Ser473) levels and the cell death were blocked by LY294002 (P<0.05).CONCLUSION: A certain concentration of shikonin reduces OGD-induced apoptosis of rat primary cortical neurons by activating PI3K/Akt signaling pathway.     

二甲基二硫的生物活性评价及对土壤养分的影响

采用室内生物活性测定方法,评价二甲基二硫(dimethyl disulfide,DMDS)对土壤病原线虫和土传病原菌的毒力,比较不同浓度药剂处理对土壤理化性质和土壤呼吸的影响,为探究DMDS作为新型土壤熏蒸剂提供切实可行性的依据。结果表明:DMDS熏蒸对土传病原线虫和镰刀菌属的LD_(50)分别为4.743 mg/kg和1.513 mg/kg,可见DMDS对病原线虫和镰刀菌有良好的生物活性。对土壤理化性质进行数据分析发现:DMDS能显著增加土壤铵态氮含量,抑制硝化作用过程,减少NO~-_3-N的产生,提高植物可吸收态氮素水平。DMDS处理的土壤有机质含量和电导率均显著高于对照土壤,而土壤pH和速效钾含量较对照均有降低。此外,熏蒸土壤中有效磷含量较对照减少,但两者无显著差异。对DMDS熏蒸后土壤进行底物诱导呼吸试验,表明DMDS能够在试验初期抑制土壤微生物生物量。本试验结果可为指导DMDS的科学使用提供理论依据及对土壤微生物活性的影响作出科学评价。     

豆-禾混播草地中紫花苜蓿比例对其固氮效率的影响及潜在生理机制

【目的】 通过研究豆草比例对紫花苜蓿-羊草混播草地豆科植物生物固氮的影响及其生理生态机制,深化对混播群落结构和生物固氮功能关系的理解,辅助豆-禾混播草地的科学建植和管理,提高混播草地生物固氮和土壤肥力,提升草地资源生产和生态保障能力。【方法】 2017年5月,利用紫花苜蓿和羊草为试验材料,采取随机区组设计,于中国科学院长岭草地农牧生态研究站内建植不同豆草比例（紫花苜蓿占比为25%、50%、75%、100%）的紫花苜蓿-羊草混播草地,4次重复。建植一年后,通过样方取样法调查混播草地群落结构变化,测定紫花苜蓿叶片、枝条和根系生长发育、光合和水分等生理代谢特征,在测定根系结瘤特征基础上,采取¹⁵N同位素自然丰度法评估紫花苜蓿固氮效率,结合土壤水分动态监测,分析豆草比例对紫花苜蓿生物固氮的影响及其生理生态机制。【结果】 （1）混播草地建植一年后,对应25%、50%、75% 和100%设计的豆草混播比例,混播草地实际紫花苜蓿占比分别为11%、27%、53%和100%。（2）对比25%、75%和100%的初始豆草种植比例,50%的初始豆草比例下,生长季平均土壤水分含量分别增加了21.4%、36.4%和51.7%。（3）50%豆草种植比例下,紫花苜蓿植株有更大的枝条和根系生物量、叶片数量、叶片面积、叶片厚度和叶片生物量,上述指标最小值出现在100%的豆草播种比例。（4）50%豆草种植比例下,紫花苜蓿具有最大的光合速率,枝条和根系中淀粉含量最高,但枝条和根系中可溶性糖含量最低。（5）50%的初始豆草混播比例下,紫花苜蓿根瘤发育更完善,其生物固氮率较25%、75%和100%的豆草混播比例分别提高了13.5%、44.6%和79.2%。回归分析表明,随豆草比例变化,紫花苜蓿生物固氮效率与土壤含水量呈正相关。【结论】 紫花苜蓿-羊草混播草地中,紫花苜蓿生物固氮能力与豆草比例间存在非直线型变化关系。当初始豆草种植比例为50%时,紫花苜蓿生物固氮率最大。豆草比例驱动土壤水分变化,进而通过调控叶片发育和光合等途径改变了紫花苜蓿植株和根瘤发育,是其影响生物固氮的潜在机制。     

一个CRISPR/Cas9-VQR基因编辑系统的构建

CRISPR/Cas9系统是一种广泛应用于细菌、酵母、动物和植物中的基因组定点编辑技术,但该编辑系统的使用范围受PAM (proto-spacer-motif)位点NGG的限制。本研究通过突变Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9)编码氨基酸(1135位的天冬氨酸D突变成缬氨酸V, 1335位的精氨酸R突变为谷胱氨酸Q, 1337位的苏氨酸T突变为精氨酸R,命名该突变子为Cas9-VQR)改造其识别PAM为NGA的位点以扩大其使用范围。并使用玉米Ubi启动子启动Cas9-VQR基因、优化SpCas9的密码子、加入保守的核定位信号序列、增加单子叶植物中保守的3′UTR序列和使用水稻U6启动子启动gRNA来修饰该编辑系统。结果表明Cas9-VQR系统能够识别PAM为NGA的位点,并进行有效的切割。体外酶切活性检测结果表明Cas9-VQR的切割效率为5%～70%。水稻转化检测结果表明Cas9-VQR的切割效率约为27.5%～70.5%,平均切割效率为46.23%。本研究拓宽了CRISPR/Cas9系统在作物中的使用范围,特别是NGA PAM位点较高的作物。